Γεννήθηκε στην Κύμη Ευβοίας το 1883. Αποφοίτησε από την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Αθηνών. Έκανε μεταπτυχιακές σπουδές και διδακτορικό στη Γερμανία. Επέστρεψε στην Ελλάδα και πολέμησε στους Βαλκανικούς πολέμους το 1912-13. Στη συνέχεια μετανάστευσε με τη σύζυγό του στην Αμερική και προσλήφθηκε στο Πανεπιστήμιο Cornell το 1914. Το 1928 παρουσίασε την πρώτη του εργασία για πρώιμη διάγνωση του καρκίνου. Το 1941 δημοσίευσε τα ευρήματά του σχετικά με την αξία της μελέτης των κυττάρων από επιχρίσματα του κόλπου και του τραχήλου και το 1943 δημοσίευσε μαζί με τον Traut την κλασική και διάσημη εργασία του που καθιέρωσε την προληπτική μελέτη των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.
Άρχισαν αμέσως να εφαρμόζονται προγράμματα μαζικού ελέγχου του πληθυσμού, τα οποία επεκτάθηκαν από το 1960 και στην Ευρώπη.
Το 1954 εξέδωσε τον Άτλαντα της Αποφολιδωτικής Κυτταρολογίας, που θεωρείται μνημειώδες έργο και στο οποίο περιγράφονται τεχνικές μελέτης κυττάρων από διάφορα όργανα του σώματος. Επισκέφθηκε την Ελλάδα το 1957 και του αποδόθηκαν ιδιαίτερες τιμές.
Ο Παπανικολάου είχε την ικανοποίηση να δει το έργο του να αναγνωρίζεται σε παγκόσμια κλίμακα. Δέχθηκε αμέτρητες εκδηλώσεις ευγνωμοσύνης και τιμήθηκε διεθνώς με πάρα πολλά βραβεία και διακρίσεις. Το 1961 ανέλαβε τη διεύθυνση του Αντικαρκινικού Ινστιτούτου Έρευνας, που ιδρύθηκε στο Μαϊάμι της Φλόριντας, στο οποίο είχε δοθεί το όνομά του. Εργάστηκε μέχρι τις τελευταίες μέρες της ζωής του. Πέθανε από καρδιακή προσβολή το 1962.
